EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠/電泳遷移率實(shí)驗技術(shù)服務(wù)常見(jiàn)問(wèn)題

1、EMSA原理及方法

EMSA 稱(chēng)凝聚阻滯實(shí)驗或凝膠電泳遷移率檢測， 是一種用于研究轉錄因子和其相關(guān)的 DNA 結合序列相互作用的技術(shù)， 能對各類(lèi)轉錄因子的 DNA 結合活性進(jìn)行定性和半定量分析，是一項研究細胞信號轉導通路的關(guān)鍵實(shí)驗技術(shù)。

EMSA 主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過(guò)程中遷移較慢的原理。根據實(shí)驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復合物；這種復合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒(méi)有結合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會(huì )在膜靠前的位置形成一條帶，說(shuō)明有蛋白與目標探針有互作。

2、看不到遷移條帶

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒(méi)有可以與探針結合的蛋白。

3）探針與蛋白無(wú)特異性的相互作用。

4）轉膜效率低，蛋白或者探針未轉移到膜上。

5）曝光或者成像時(shí)間過(guò)短。

6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因：

a. 抗體沒(méi)有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

b. 測定的活化的 DNA/蛋白復合物中沒(méi)有希望檢測的構成成分存在。此時(shí)既看不到 Super-Shift 的帶，也看不到 DNA/蛋白復合物的量的減少。

c. 使用的抗體過(guò)度稀釋。一般 10～20 ul 的反應液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗體。

d. 多抗與 DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到 Super-Shift 的帶，但應當可以看到 DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。

3、實(shí)驗背景高

1）曝光或者成像時(shí)間過(guò)長(cháng)。

2）封閉時(shí)間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實(shí)驗過(guò)程中膜沒(méi)有一直處于濕潤狀態(tài)。

5）蛋白的質(zhì)量不高，雜質(zhì)多

4、EMSA如何設置對照實(shí)驗及其目的

EMSA實(shí)驗會(huì )有如下對照組：
(1)陰性對照反應(標記探針)；
(2)常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針)；
(3)探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記探針)；
(4)突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記突變探針)；
(5)Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋目的轉錄因子的特異抗體)。

每個(gè)對照組的目的：
(1)確定探針里面是否有雜質(zhì)，光有探針，沒(méi)有其他成分時(shí)，探針的位置，應該位于下方。
(2)這個(gè)是看蛋白和探針的結合，是實(shí)驗目的
(3)看探針結合的特異性。如果冷探針可以競爭結合，阻礙了標記的探針，說(shuō)明2中的結合是特異的
(4)目的和3相同。突變的冷探針應該對2的結果沒(méi)有影響
(5)也是判斷特異性，這次是看蛋白的特異性，和抗體結合后，就會(huì )有super-shift。如果沒(méi)有，說(shuō)明是其他的蛋白結合。

5、EMSA非放射性探針設計注意事項

（1）EMSA探針不宜太長(cháng)，一般是幾十堿基對。太長(cháng)會(huì )產(chǎn)生過(guò)多結合位點(diǎn)導致結果分析困難，還會(huì )產(chǎn)生超級螺旋結構而掩蓋結合部位

（2）注意AT/GC比例

（3）防止產(chǎn)生空間位阻

（4）防止錯位配對、封閉成環(huán)，排除目標序列以外結合位點(diǎn)

（5）推薦Biotin或紅外熒光標記，盡量不要用DIG標記。