更新時(shí)間:2024-07-01
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EMSA凝膠/電泳遷移率實(shí)驗技術(shù)服務(wù)常見(jiàn)問(wèn)題
1、EMSA原理及方法
EMSA 稱(chēng)凝聚阻滯實(shí)驗或凝膠電泳遷移率檢測, 是一種用于研究轉錄因子和其相關(guān)的 DNA 結合序列相互作用的技術(shù), 能對各類(lèi)轉錄因子的 DNA 結合活性進(jìn)行定性和半定量分析,是一項研究細胞信號轉導通路的關(guān)鍵實(shí)驗技術(shù)。
EMSA 主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過(guò)程中遷移較慢的原理。根據實(shí)驗設計特異性和非特異性探針,當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí),樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大,在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢,而沒(méi)有結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后,蛋白-探針復合物會(huì )在膜靠前的位置形成一條帶,說(shuō)明有蛋白與目標探針有互作。
2、看不到遷移條帶
1)蛋白樣本提取質(zhì)量不高,蛋白降解或者提取量不足。
2)樣本中沒(méi)有可以與探針結合的蛋白。
3)探針與蛋白無(wú)特異性的相互作用。
4)轉膜效率低,蛋白或者探針未轉移到膜上。
5)曝光或者成像時(shí)間過(guò)短。
6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因:
a. 抗體沒(méi)有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA,只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。
b. 測定的活化的 DNA/蛋白復合物中沒(méi)有希望檢測的構成成分存在。此時(shí)既看不到 Super-Shift 的帶,也看不到 DNA/蛋白復合物的量的減少。
c. 使用的抗體過(guò)度稀釋。一般 10~20 ul 的反應液需要使用 0.5~1 ul 原倍的抗體。
d. 多抗與 DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下,雖然看不到 Super-Shift 的帶,但應當可以看到 DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。
3、實(shí)驗背景高
1)曝光或者成像時(shí)間過(guò)長(cháng)。
2)封閉時(shí)間不足或者效率不高。
3)洗滌效果不佳。
4)實(shí)驗過(guò)程中膜沒(méi)有一直處于濕潤狀態(tài)。
5)蛋白的質(zhì)量不高,雜質(zhì)多
4、EMSA如何設置對照實(shí)驗及其目的
EMSA實(shí)驗會(huì )有如下對照組:
(1)陰性對照反應(標記探針);
(2)常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針);
(3)探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記探針);
(4)突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記突變探針);
(5)Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+目的轉錄因子的特異抗體)。
每個(gè)對照組的目的:
(1)確定探針里面是否有雜質(zhì),光有探針,沒(méi)有其他成分時(shí),探針的位置,應該位于下方。
(2)這個(gè)是看蛋白和探針的結合,是實(shí)驗目的
(3)看探針結合的特異性。如果冷探針可以競爭結合,阻礙了標記的探針,說(shuō)明2中的結合是特異的
(4)目的和3相同。突變的冷探針應該對2的結果沒(méi)有影響
(5)也是判斷特異性,這次是看蛋白的特異性,和抗體結合后,就會(huì )有super-shift。如果沒(méi)有,說(shuō)明是其他的蛋白結合。
5、EMSA非放射性探針設計注意事項
(1)EMSA探針不宜太長(cháng),一般是幾十堿基對。太長(cháng)會(huì )產(chǎn)生過(guò)多結合位點(diǎn)導致結果分析困難,還會(huì )產(chǎn)生超級螺旋結構而掩蓋結合部位
(2)注意AT/GC比例
(3)防止產(chǎn)生空間位阻
(4)防止錯位配對、封閉成環(huán),排除目標序列以外結合位點(diǎn)
(5)推薦Biotin或紅外熒光標記,盡量不要用DIG標記。
相關(guān)技術(shù)服務(wù):
1、 DNA親和純化測序(DAP-seq):高通量檢測轉錄因子或DAN結合蛋白在基因組上的結合位點(diǎn)。
2、 酵母單雜交:DAP-seq后續驗證服務(wù)
3、 ChIP-seq:高效檢測重組蛋白、轉錄因子在基因組的結合位點(diǎn)
4、 DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析: 分析轉錄因子的靶基因在RNA-seq數據中的表達變化,深入挖掘DAP-seq和RNA-seq測序數據,增加轉錄組測序的分析深度。
5、 DNA-pull down:鑒定與DNA結合的蛋白。
6、 精美的論文圖片設計與制作:專(zhuān)業(yè)設計師,設計精美論文插圖,提升論文的嚴謹性和美觀(guān)度。
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