DAP-seq助力揭示GhRCD1促進(jìn)棉花對鎘的耐受調節機制

鎘（Cd²⁺）是環(huán)境中最常見(jiàn)的有害重金屬之一，嚴重威脅作物生產(chǎn)力和質(zhì)量以及食品安全。Cd²⁺容易被植物從土壤中吸收，并通過(guò)可食用的植物器官和谷物進(jìn)入食物鏈，對食品質(zhì)量、糧食安全和公共安全構成威脅。

植物修復是減少土壤污染的有效途徑之一。棉花作為一種重要的非食用經(jīng)濟作物，與糧食作物（小麥、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆類(lèi)、黃瓜和番茄）相比，在修復土壤Cd²⁺污染方面具有天然優(yōu)勢，避免了Cd²⁺進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險。因此，探究棉花響應鎘脅迫的調控機制至關(guān)重要。

2024年1月16日，中國農業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣研究員團隊的研究成果，發(fā)表在Plant Biotechnology Journal期刊上（IF=13.8），文章題目是“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade" 。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）等分子相互作用研究方法，發(fā)現了調節棉花Cd2+耐受性的分子級聯(lián)反應，揭示了GhRCD1通過(guò)調控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1轉錄級聯(lián)通路響應鎘脅迫的分子機制，為培育耐鎘棉花新品種和通過(guò)植物修復手段降低鎘污染提供了新思路。

1.突變ghrcd1 基因降低棉花Cd²⁺耐受性

為探究Cd²⁺對棉花毒性的分子機制，作者通過(guò)T-DNA插入得到對Cd²⁺敏感的突變體ghrcd1。Cd²⁺處理后，通過(guò)表型觀(guān)察，RT-qPCR分析，PI染色，葉綠體結構觀(guān)察，SPAD分析等實(shí)驗發(fā)現，ghrcd1幼苗比WT植株表現出更低的Cd²⁺耐受性，這表明，抑制GhRCD1表達會(huì )降低棉花Cd²⁺耐受性，GhRCD1在棉花應對鎘脅迫時(shí)具有正向調節作用。

2.敲除棉花GhRCD1基因，降低棉花Cd²⁺耐受性

為了進(jìn)一步研究GhRCD1在棉花耐鎘脅迫中的作用，作者構建了KO-GhRCD1株系和OE-GhRCD1株系。Cd²⁺處理后，通過(guò)表型觀(guān)察，PI染色，葉綠體結構觀(guān)察，SPAD分析等實(shí)驗發(fā)現，與WT相比，KO-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更低，OE-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更高。這些結果表明GhRCD1能減弱Cd²⁺對棉花的毒性。

3.GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內均存在相互作用

作者使用GhRCD1為誘餌蛋白，對棉花應激響應蛋白庫進(jìn)行Y2H篩選，結果發(fā)現GhbHLH12轉錄因子與GhRCD1存在相互作用。而后通過(guò)BiFC、GST pull down和LCI實(shí)驗進(jìn)一步驗證了這一結果。這些結果表明GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內都能與GhbHLH12相互作用。

4.抑制GhbHLH12表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12是否參與了棉花應對Cd²⁺脅迫的反應，作者構建了棉花的OE-GhbHLH12株系和GhbHLH1-RNAi株系。Cd²⁺處理后，GhbHLH1-RNAi的Cd²⁺耐受性增加，OE-GhbHLH12的Cd²⁺耐受性降低。為確定GhbHLH12在調節Cd²⁺耐受性中是否有基因依賴(lài)性，作者敲除GhbHLH12得到KO-GhbHLH12株系，Cd²⁺處理后，KO-GhbHLH12植株比對照植株具有更高的耐受性。這些結果說(shuō)明，抑制GhbHLH12表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。

5.GhRCD1減弱GhbHLH12對GhMYB44的轉錄抑制作用，提高棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12抑制棉花Cd²⁺耐受性的機制，作者對WT幼苗進(jìn)行了RNA-seq和DAP-seq聯(lián)合分析。DAP-seq結果顯示GhbHLH12在GhMYB44的啟動(dòng)子區域有顯著(zhù)富集，而后，Y1H和EMSA實(shí)驗證實(shí)了GhbHLH12蛋白和GhMYB44的結合基序G-box相互作用。LUC/REN報告實(shí)驗表明GhbHLH12抑制GhMYB44的轉錄，而GhRCD1可以減弱GhbHLH12對GhMYB44的抑制作用，EMSA結果也表明GhRCD1減弱了GhbHLH12與GhMYB44的結合，結合RT-qPCR實(shí)驗結果，說(shuō)明GhRCD1和GhbHLH12分別是Cd²⁺耐受性的正負調節因子，并且在Cd²⁺脅迫下，轉錄調控存在復雜的相互作用。

6.GhMYB44表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhMYB44響應Cd²⁺脅迫的機制，作者構建了GhMYB44-OE1/5株系和GhMYB44-SRDX1/6株系。Cd²⁺處理后，與WT相比，GhMYB44-OE表現出更高的Cd²⁺耐受性，而SRDX-GhMYB44-1/6植株表現出更低的耐受性。這表明GhMYB44表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。隨后作者采用VIGS技術(shù)沉默對照和KO-GhbHLH12株系中的GhMYB44基因，結果表明GhMYB44在GhbHLH12的下游發(fā)揮作用。

7.棉花應對Cd²⁺脅迫的GhMYB44–GhHMAs轉錄級聯(lián)反應

為探究棉花中GhMYB44提高Cd²⁺耐受性的作用機制，作者利用DAP-seq技術(shù)找到GhMYB44的10207個(gè)潛在結合位點(diǎn)，其中61.42％位于基因間區，22.31％位于啟動(dòng)子區。GO分析顯示，靶基因顯著(zhù)富集在脅迫應答（GhWRKY13和GhWRKY51）和金屬離子結合和運輸（GhHMA1、GhHMA2和GhHMA5）通路。為研究GhMYB44是否通過(guò)GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺轉運中發(fā)揮調控作用，作者通過(guò)Y1H、EMSA實(shí)驗驗證了GhMYB44特異性結合GhHMA１和GhHMA5的G-box（CATGTG）順式作用元件。LUC/REN報告實(shí)驗結果表明，GhMYB44可以直接激活GhHMA1和GhHMA5的轉錄來(lái)調控Cd²⁺的轉運。RT-qPCR分析表明Cd²⁺誘導GhHMA1和GhHMA5的上調在很大程度上取決于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能。

為進(jìn)一步探究GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺耐受機制中的生物功能，作者采用VIGS技術(shù)沉默棉花中的GhHMA1和GhHMA5基因，生成沉默品系，Cd²⁺處理后，沉默品系對Cd²⁺表現出更高的敏感性。結果表明GhMYB44-GhHMA1/5信號級聯(lián)反應正向調控棉花的Cd²⁺耐受性。

8.GhMYB44和GhPYL8協(xié)同調節ABA介導的Cd²⁺耐受性

為研究GhMYB44是否與ABA受體相互作用介導Cd²⁺耐受性，作者進(jìn)行Y2H測定發(fā)現GhMYB44與ABA受體GhPYL8相互作用。隨后通過(guò)BiFC和蛋白pull-down實(shí)驗驗證了這一結果。為研究GhPYL8的生理功能，作者構建了OE-GhPYL8-1/3/6株系，Cd²⁺處理后，與WT相比，OE - GhPYL8對Cd²⁺的耐受性更高。這些結果表明GhMYB44可以與GhPYL8相互作用來(lái)調節ABA介導的Cd²⁺耐受性。

小結：

本研究揭示了一個(gè)調控級聯(lián)反應，即GhRCD1–GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1，闡明了棉花耐Cd²⁺遺傳調控的分子機制，為棉花耐Cd²⁺優(yōu)良品種的開(kāi)發(fā)奠定了基礎，預示著(zhù)棉花植物修復的新時(shí)代。