DAP-seq助力揭示轉錄因子在草地貪夜蛾Bt抗性中重要作用

2024年4月6日，武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉磊磊課題組在International Journal of Biological Macromolecules（中科院一區，影響因子8.2）期刊在線(xiàn)發(fā)表了“Contribution of the transcription factor SfGATAe to Bt Cry toxin resistance in Spodoptera frugiperda through reduction of ABCC2 expression"的研究論文。該團隊利用DAP-seq等技術(shù)闡明了轉錄因子SfGATAe對毒素受體基因SfABCC2表達的調控機制，并全面闡釋了這種轉錄調控機制對草地貪夜蛾Bt抗性產(chǎn)生的重要影響。這項研究為探索SfGATAe在抗性機制中的作用，并為開(kāi)發(fā)以SfGATAe為靶點(diǎn)的生物農藥奠定了重要理論基礎。

ABCC2轉運蛋白屬于多次跨膜蛋白，其不同情況的突變能引起機體對Bt毒素不同程度的抗性，SfABCC2轉運蛋白介導的草地貪夜蛾對Bt毒素抗性研究具有重要的意義。而鱗翅目昆蟲(chóng)中特異性毒素受體的轉錄水平調控與昆蟲(chóng)Bt抗性關(guān)系知之甚少，GATA轉錄因子屬于鋅指蛋白家族，包含位于 NH2 末端區域的轉錄激活域、兩個(gè)高度保守的鋅指區域、一個(gè)核定位信號序列和一個(gè)未知功能的 COOH 末端域， GATAe 通過(guò)調節中腸組織特異性基因的表達，參與中腸干細胞的發(fā)育和分化。

圖1草地貪夜蛾卵巢細胞系中的亞細胞定位分析

該研究團隊運用了DAP-seq技術(shù)，以高通量、高分辨率的鑒定了SfGATAe的直接轉錄結合位點(diǎn)。該研究共識別出了19,740個(gè)結合峰，其中1,507個(gè)位點(diǎn)位于啟動(dòng)區。該研究通過(guò)構建一系列截短載體，并利用雙熒光素報告系統評估了每個(gè)構建對報告基因的驅動(dòng)能力，并成功鑒定了調控元件的關(guān)鍵區域。通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗、DNA pull down和定點(diǎn)突變等實(shí)驗，確定了轉錄因子SfGATAe在A(yíng)BCC2靶基因中的核心控制位點(diǎn)。

圖2 SfGATAe 與ABCC2受體啟動(dòng)子結合關(guān)鍵區域鑒定

圖3 SfGATAe結合啟動(dòng)子區的DNA基序鑒定

轉錄因子SfGATAe在草地貪夜蛾時(shí)空表達分析表明，SfGATAe的在中腸表達水平都顯著(zhù)高于非中腸器官，中腸中SfGATAe的增強表達可能表明其參與調節昆蟲(chóng)代謝或解毒過(guò)程，尤其在調控Cry1Ac毒素受體ABCC2方面的重要作用。

圖4 SfGATAe在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段和各部位時(shí)空表達模式

SfGATAe表達水平降低導致SfABCC2受體表達減少，進(jìn)而導致幼蟲(chóng)對Cry1Ac毒素的敏感性降低。SfGATAe與SfABCC2基因啟動(dòng)子內的關(guān)鍵結合位點(diǎn)的結合調節了SfABCC2蛋白的表達。SfGATAe在腸道內表現出高水平表達，敲降SfGATAe表達，幼蟲(chóng)體內SfABCC2的表達降低。該研究加強了對鱗翅目害蟲(chóng)中ABCC2的后轉錄調控的理解，為進(jìn)一步探索SfGATAe在調控Cry1Ac和其他殺蟲(chóng)劑抗性機制中的功能奠定基礎。

圖5 抑制SfGATAe表達量減少ABCC2表達水平導致草地貪夜蛾對Bt抗性