DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析助力揭示AvERF73參與調控低氧應答和甲羥戊酸途徑

澇害（Waterlogging）是長(cháng)期陰雨或暴雨后，由于地表積水，地面徑流不能及時(shí)排除，積水深度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(cháng)，造成作物根部氧氣不足，并產(chǎn)生乙醇等有毒有害物質(zhì)，從而影響作物生長(cháng)，甚至造成作物死亡，造成農業(yè)減產(chǎn)的災害。

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）也稱(chēng)奇異果，原產(chǎn)于中國。目前已經(jīng)躋身于世界主流消費水果之列。獼猴桃可以預防老年骨質(zhì)疏松，防治動(dòng)脈硬化，改善心肌功能，防治心臟病，也能對抗癌起作用。

2024年2月2日，中國農業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所果樹(shù)生長(cháng)發(fā)育與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗室的研究成果，發(fā)表在Horticultural Plant Journal期刊上（IF=5.7），文章題目為“AvERF73 positively regulates waterlogging tolerance in kiwifruit by participating in hypoxia response and mevalonate pathway" 。該研究使用DNA親和測序（DAP-seq）技術(shù)和轉錄組測序（RNA-seq）技術(shù)揭示了AvERF73通過(guò)參與低氧應答和甲羥戊酸途徑，正調控獼猴桃的耐澇性。

1.對AvERF73進(jìn)行序列分析

作者在A(yíng). valvata KR5中鑒定出一個(gè)受洪澇誘導的ERF-VII基因，命名為AvERF73。隨后，作者檢測了AvERF73在不同組織中的表達情況，發(fā)現其在根系中的含量最高。系統發(fā)育樹(shù)分析顯示，AvERF73與AcERF74的蛋白序列相似。蛋白序列分析顯示，AvERF73含有一個(gè)AP2保守結構域，這個(gè)結構域含有Ala14和Asp19保守位點(diǎn)，說(shuō)明AvERF73屬于ERF轉錄家族。之后作者將AvERF73與GFP融合表達，并在細胞核中檢測到GFP熒光，證明AvERF73定位于細胞核中。

2.在擬南芥中過(guò)表達AvERF73提高了擬南芥的耐澇害能力

為研究AvERF73基因的功能，作者在擬南芥中過(guò)表達AvERF73基因，進(jìn)行澇脅迫，發(fā)現過(guò)表達植株比WT植株更耐澇害，證實(shí)了AvERF73的過(guò)表達增強了擬南芥的耐澇害能力。

3.過(guò)表達AvERF73增強了獼猴桃的耐澇害能力

為進(jìn)一步證實(shí)AvERF73在獼猴桃中的作用，作者利用“紅陽(yáng)"獼猴桃葉條外植體轉化獲得了兩個(gè)過(guò)表達的獼猴桃品系OE53和OE65。澇脅迫后， 與過(guò)表達品系相比，WT植株出現了明顯的葉片枯萎癥狀，葉綠素水平降低，根部H2O2和MDA含量升高，而過(guò)表達品系生長(cháng)良好。表明AvERF73在應對澇脅迫方面發(fā)揮著(zhù)有益的作用。

4.轉錄組分析鑒定AvERF73調控的基因

為了更好地探究AvERF73在澇脅迫下的分子機制，作者對OE53和WT植株進(jìn)行轉錄組測序（RNA-seq）。qRT-PCR檢測和相關(guān)性分析均表明轉錄組數據準確可靠。結果分析發(fā)現，在澇脅迫下，與WT植株相比，OE53植株的上調基因在“cellular response to hypoxia"途徑顯著(zhù)富集，這些低氧應答基因（HRGs )包含很多轉錄因子，例如LOB，WRKY，鋅指蛋白和NAC。，此外，上調基因在萜類(lèi)化合物和甾醇生物合成過(guò)程也顯著(zhù)富集，并且編碼MVA途徑關(guān)鍵酶的基因表達上調。由此推測AvERF73可能調控HRGs的表達，同時(shí)激活MVA通路積累萜類(lèi)化合物和甾醇來(lái)應對澇脅迫。

5.全基因組范圍內鑒定AvERF73的靶基因

為了鑒定AvERF73調控的靶基因，作者以OE53和WT植物的根部為材料進(jìn)行了DAP-seq。兩次重復共鑒定到3744個(gè)基因，同時(shí)鑒定到AvERF73結合的GCC-box (‘GCCGCC’) motif。隨后作者將DAP-seq與RNA-seq數據聯(lián)合分析，找到了16個(gè)上調的AvERF73 可能直接靶向基因（DTGs）并進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。

6.AvERF73直接參與缺氧應答和MVA通路提高獼猴桃的耐澇漬能力

為了進(jìn)一步揭示AvERF73的潛在DTG。Venn圖分析發(fā)現，在"cellular response to hypoxia"和MVA途徑中，AcNAC022和AcHMGS1基因為AvERF73的潛在DTGs。Dual-Luc實(shí)驗發(fā)現AcNAC022和AcHMGS1與AvERF73蛋白呈正相關(guān)關(guān)系。據此推測，AvERF73調控了AcNAC022和AcHMGS1的表達。

小結

結果表明，AvERF73是獼猴桃耐澇性的重要調節因子。一方面，過(guò)表達AvERF73可以激活AcNAC022的表達，以應對澇脅迫引起的缺氧。另一方面，過(guò)表達AvERF73可能通過(guò)直接激活AcHMGS1表達來(lái)調節合成萜類(lèi)化合物和甾醇的MVA途徑。然而，AvERF73與AcNAC022和AcHMGS1的相互作用調控獼猴桃耐澇能力的機制有待進(jìn)一步探索。本研究結果為研究獼猴桃耐澇調控網(wǎng)絡(luò )提供了候選基因和新思路。