DAP-seq鑒定BcERF070下游靶基因，揭示乙烯調控小白菜開(kāi)花機制

不結球白菜（Pak-choi），俗稱(chēng)小白菜，是一種原產(chǎn)于中國的多葉狀蔬菜，已逐漸在世界范圍內種植。小白菜易于早熟的特性，限制了生長(cháng)發(fā)育和產(chǎn)量積累。因此，了解小白菜的開(kāi)花調控機制對育種和產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

2024年1月25日，南京農業(yè)大學(xué)白菜系統生物學(xué)實(shí)驗室的研究成果發(fā)表在Plant Physiology期刊上（影響因子7.4），題目為“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression"。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）技術(shù)鑒定了小白菜中BcERF070的下游靶基因，揭示了BcERF070響應乙烯抑制小白菜開(kāi)花的潛在分子機制。

1.BcERF070響應乙烯，延緩小白菜開(kāi)花

在外源乙烯處理條件下，小白菜開(kāi)花延遲，蓮座葉數量增加，BcERF070的表達增加，并在處理2 h時(shí)達到峰值。此外，BcERF070的轉錄水平在整個(gè)營(yíng)養生長(cháng)期逐漸下降，并在生殖期達到谷值。因此BcERF070參與了乙烯介導的開(kāi)花調控。BcERF070基因沉默后，促進(jìn)小白菜提早開(kāi)花，蓮座葉數量降低，BcFT誘導表達。因此，BcERF070在小白菜開(kāi)花過(guò)程中起到負向調節作用。乙烯處理的沉默植株開(kāi)花時(shí)間明顯提前，但晚于未處理組。由此表明BcERF070參與小白菜開(kāi)花調控的途徑有很多。

圖1. BcERF070基因沉默后促進(jìn)小白菜開(kāi)花，并響應乙烯。

2.BcERF070與BcMLP328相互作用

采用Y2H實(shí)驗篩選到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328，隨后使用BiFC、LCI、GST pull down、Co-IP實(shí)驗驗證了這一結果。然而，BcERF070和BcMLP328相互作用調控開(kāi)花的機制尚不清楚

圖2. BcERF070與BcMLP328相互作用。

3.BcMLP328促進(jìn)小白菜開(kāi)花

乙烯處理小白菜促使BcMLP328的表達量降低。此外，BcMLP328僅在花器官中高表達。這表明BcMLP328可能與開(kāi)花過(guò)程有關(guān)。隨后在小白菜中構建了BcMLP328的過(guò)表達株系和沉默株系，通過(guò)表型觀(guān)察分析和開(kāi)花相關(guān)基因（BcSOC1、BcSPL15、BcFT、BcAP3、BcTEM）表達量檢測，實(shí)驗結果表明BcMLP328促進(jìn)小白菜開(kāi)花。然而，BcMLP328促進(jìn)開(kāi)花的機制尚不清楚。

圖3. BcMLP328響應乙烯，并促進(jìn)小白菜開(kāi)花。

4.BcMLP328增強了BcbHLH30對BcLFY的轉錄活性

采用Y2H實(shí)驗篩選到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30，隨后使用LCI、BiFC、Co-IP實(shí)驗驗證了BcMLP328和BcbHLH30在體內和體外的互作。隨后在小白菜中構建BcbHLH30沉默株系，發(fā)現在沉默株系中開(kāi)花延遲、蓮座葉增多、開(kāi)花調控基因（BcFT和BcLFY）表達量降低。這些結果表明，BcbHLH30正調控小白菜開(kāi)花過(guò)程。

圖4. BcbHLH30與BcMLP328相互作用，促進(jìn)小白菜開(kāi)花。

采用Y1H實(shí)驗篩選BcbHLH30下游靶基因，發(fā)現BcbHLH30直接結合花相關(guān)基因BcLFY的啟動(dòng)子，激活其表達。LUC實(shí)驗驗證了這一結論。隨后，ChIP-qPCR實(shí)驗檢測到在過(guò)表達BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被顯著(zhù)富集，EMSA實(shí)驗證明了BcbHLH30與BcLFY啟動(dòng)子區的CATTTG-box結合。共轉化煙草葉片實(shí)驗表明BcMLP328增強了BcbHLH30對BcLFY的激活能力。

圖5. BcbHLH30與BcLFY啟動(dòng)子結合并增強其表達。

5.BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活

為了驗證BcERF070對于BcMLP328與BcbHLH30互作的影響，使用LCI實(shí)驗證明，BcMLP328和BcbHLH30共轉染組中熒光明顯增強，然而在加入BcERF070之后，熒光強度顯著(zhù)降低。EMSA實(shí)驗也驗證了這一結論。因此，BcERF070對BcMLP328與BcbHLH30的相互作用產(chǎn)生負向影響，這可能會(huì )降低BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的轉錄激活。

推測BcERF070是通過(guò)破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物進(jìn)而延遲開(kāi)花，那么BcMLP328沉默株系、BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開(kāi)花時(shí)間理應相似。但出乎意料的是，BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開(kāi)花時(shí)間早于BcMLP328沉默株系，蓮座葉也較少。由此推測BcERF070也可能通過(guò)破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物以外的途徑來(lái)影響開(kāi)花。

圖6. BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復合物的激活活性。

6.BcERF070通過(guò)直接與BcBBX29啟動(dòng)子結合增強其表達

采用DAP-seq分析可視化觀(guān)察到在Bcc29的啟動(dòng)子區域存在較強的BcERF070結合峰，以及在BcBBX29的啟動(dòng)子上可能存在結合區域。Y1H、Dual-LUC報告實(shí)驗、EMSA實(shí)驗進(jìn)一步驗證了BcERF070與BcBBX29啟動(dòng)子結合并激活其表達。與對照株系相比，BcBBX29沉默株系的開(kāi)花時(shí)間更早、蓮座葉更少、BcFT表達更強。在過(guò)表達BcBBX29的擬南芥中觀(guān)察到開(kāi)花時(shí)間更晚、蓮座葉更多。以上實(shí)驗結果表明，BcERF070通過(guò)直接激活BcBBX29的轉錄來(lái)延緩開(kāi)花。

圖7. BcERF070直接與BcBBX29啟動(dòng)子結合，激活其表達。

圖8. 小白菜中BcERF070調控晚開(kāi)花的分子機制模型。

在沒(méi)有乙烯的情況下，BcERF070的表達量較低，導致開(kāi)花提前。然而，在乙烯存在的情況下，BcERF070的表達被誘導，增加的BcERF070通過(guò)直接互作破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活，導致開(kāi)花延遲；另外BcERF070還通過(guò)直接促進(jìn)開(kāi)花抑制子BcBBX29的表達來(lái)抑制BcFT的表達，進(jìn)而誘導晚開(kāi)花。

小結：該研究提出了BcERF070響應乙烯調控小白菜開(kāi)花的分子機制。外源乙烯處理增加了BcERF070的表達，延緩了開(kāi)花。BcERF070通過(guò)削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活來(lái)延遲開(kāi)花，此外BcERF070還直接促進(jìn)開(kāi)花抑制子BcBBX29的表達，從而降低BcFT的表達，進(jìn)而延緩開(kāi)花。本研究為乙烯介導的小白菜晚開(kāi)花提供了見(jiàn)解，并為應用乙烯調控作物生產(chǎn)奠定了基礎。

文獻來(lái)源：Zhanghong Yu, Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, Xilin Hou, Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression, Plant Physiology, 2024, kiae021,